Name:
Isabell Hoffmannbeck und Laura Kohlhepp, 2013
Annalena Mihm und Marius Fleck, 12.2015
Genbibliotheken
Als Gensuche bezeichnet die Suche eines speziellen Gens in einem Lebewesen. Hierzu wird zunächst die DNA vom Rest der Zelle isoliert. Die isolierte DNA wird mithilfe von Restriktionsenzymen in die einzelnen Gene geschnitten. Daraufhin werden die DNA-Fragmente in die Vektoren eingebaut. Als Vektor bezeichnet man ein ebenfalls durch Restriktionsenzyme geschnittenes Plasmid. Diese Plasmide werden in das Cytoplasma der E-Coli Bakterien eingeschleust und vervielfältigt. Somit trägt jedes Bakterium ein DNA-Fragment des fremden Genoms. Die Gesamtheit der Bakterien, die jeweils ein bestimmtes Gen der DNA enthalten, insgesamt aber die gesamte DNA des Lebewesens umfassen, nennt man genomische Bibliothek. Jeder Bakterienklon steht hierbei sozusagen für ein Buch in dieser Bibliothek.
Um einen kleineren Bereich von Genen, die tatsächlich zum Experimentieren genutzt werden, zu isolieren, stellt man eine cDNA-Bibliothek her. Diese besteht aus mehreren cDNAs, welche durch die Umkehrung der Transkription mithilfe des Enzyms "Reserve Transkriptase" komplementär zur mRNA ergänzt werden. Folglich wird die mRNA abgebaut und der komplementäre Strang der cDNA ergänzt. Diese doppelsträngige cDNA wird erneut in die Vektoren eingebaut und in den E-Coli Bakterien vervielfältigt. In der cDNA sind keine Introns (= nicht für Proteine codierende Genombereiche) enthalten. Da Bakterien keine Introns entfernen können, muss zum Experimentieren die (intronfreie) cDNA verwendet werden. Diese bestimmten Gene in einer cDNA oder genomischen Bibliothek findet man mithilfe von Gensonden.
Gensonden:
Ein gewünschtes Gen wird mit Hilfe von Gensonden ausfindig gemacht. Diese Gensonden sind kurze, radioaktive DNA-Stücke, die komplenentär zu dem gewünschten Gen sind und sich deshalb anlagern können.
Das ist der Vorgang zur Identifizierung eines Gens:
Zuerst wird eine mit Phagen aus der Genbibliothek infizierte E.coli Kultur auf einen Nährboden ausplattiert, wobei manche Bakterien absterben und Plaques (Löcher im Nährboden) mit Phagen hinterlassen. Auf einer bestimmten Folie werden die Phagen abgestempelt und bleiben daran haften. Mit Hilfe von Alkali und Protease wird die Phagenhülle entfernt und es bleibt einzelsträngige Phagen-DNA übrig.