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von Laura Kohlhepp

Methoden der Gentechnik

Gentechnik ist die gezielte Neukombination von DNA, allerdings setzt die Arbeit der Biologen bestimmte Bedingungen voraus:

  • Kenntnisse über die AusgangsDNA (Sequenzenanalyse)
  • Schneidewerkzeuge für die DNA (Restriktionsenzyme)
  • Transport der Fremdgene in die Zellen (Vektoren)

Außerdem sind folgende Grundoperationen für jedes gentechnische Experiment erforderlich:

  • Isolation der DNA (z.B. ein Stück der menschlichen DNA und ein bakterielles Plasmid)
  • Rekombination (Einbau der menschlichen DNA in des Plasmid)
  • Gentransfer (das Plasmid wird zusammen mit der menschlichen DNA in ein Bakterium übertragen)
  • Selektion (Überprüfung, ob das Bakterium das Plasmid aufgenommen hat)
  • Zellvermehrung

Isolation

Restriktionsenzyme sind Schneideenzyme. Sie schneiden z.B. ein bestimmtes Gen aus der menschlichen DNA. Jedes Restriktionsenzym setzt an einer bestimmten, mehrere Basen lange Erkennungssequenz an, die in beide Richtungen gleich gelesen wird (auch Palindrom genannt, ähnlich dem Wort RENTNER). Da die Enzyme an beiden Strängen zwischen der zweiten und dritten Base ansetzen, bleibt jeweils ein Stück der Einzelstränge überstehen. Diese neigen dazu sich wieder zu verschließen (sticky ends). Die isolierten Plasmide werden mit dem gleichen Enzym wie die menschliche DNA bearbeitet, dabei ist es wichtig, dass es in dem Plasmid nur eine Erkennungssequenz für das Enzym gibt.

Rekombination

Die sticky ends der geschnittenen menschlichen DNA verbinden sich mit denen des geschnittenen Plasmids. Die Lücken in den Zucker-Phosphat-Ketten werden von dem Enzym Ligase vernüpft. Jedoch entstehen dabei nur teilweise rekombinierte Plasmide, da sich die Plasmide auch wieder schließen können, ohne dass das Fremdgen eingefügt wurde. Dadurch erhält man ein Gemisch aus Plasmiden mit und ohne Fremdgen.

Gentransfer

Die Plasmide dienen als Vektoren, um das Fremdgen in ein Bakterium zu transportieren. Dafür wird die Proteinbiomembran der Bakterien durchlässig gemacht, sodass sie die Plasmide einfach durch diese aufgenommen werden können. Dadurch entstehen Bakterienkulturen mit Plasmid und mit Fremdgen, mit Plasmid aber ohne Fremdgen und Bakterien ohne Plasmid.

Selektion

Für die Selektion ist es erforderlich, dass auf den Vektoren zwei verschiedene Markergene liegen, meistens sind das zwei Antibiotikaresistenzen. Durch den Einbau der FremdDNA wird ein Markergen durchtrennt und ist dadurch nicht mehr synthetisierbar. Das hat zu Folge, dass nur Bakterien ohne Fremdgen gegen beide Antibiotika resistent sind, während die mit Fremdgen nur eine Resistenz besitzen. Mithilfe der Selektion kann man herausfinden, welche Bakterien Fremdgene haben.

Zunächst werden dafür die Bakterien auf einen Agarboden mit dem Antibiotika gegeben, gegen das beide rekombinierte Bakterienarten immun sind. Die Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben ab. Während des zweiten Selektionschrittes, werden die Bakterienkulturen auf einen zweiten Agarboden mit beiden Antibiotika übergestempelt. Dazu wird ein keimfreier Samtstempel verwendet. Die Bakterienkultur mit Fremdgen kann nicht mehr überleben. Die Muster der beider Agarböden werden verglichen, somit werden die Bakterienkulturen mit den Fremdgenen identifiziert.

Zellvermehrung

Die Bakterienkultur mit Fremdgen kann gezüchtet werden und die Bakterien übernehmen damit Aufgaben wie z.B. die Insulinherstellung.

 

Methoden der Gentechnik - Übersicht

 

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