Name: Jonas Reinhart, 2013
Lisa Happ und Selin Cetinyol, 12.2015
Carlos Weikard, 2017-01
PCR
Das Ziel der von Kaly Mullis 1983 entwickelten PCR "polymerase chain reaction" ("Polymerase-Ketten-Reaktion") ist es,aus einem oder wenigen DNA-Abschnitten eines Lebewesens eine größere,genetisch identische Menge an Erbmaterial herzustellen und dieses somit für weitere Untersuchungen (z.B. Gelelektrophorese) brauchbar zu machen.
Zur Vorbereitung dieser Reaktion ist die Isolierung der DNA erforderlich,die zusammen mit einem Puffer,freien Nukleotiden,zwei verschiedenen (nicht komplementären) Primern und einer DNA-Polymerase (Taq-DNA-Polymerase) in den Reaktionsansatz gegeben wird.Die nun folgende,eigentliche Reaktion findet in einem programmgesteuerten Heizgerät,dem Thermocycler statt,mit dem es möglich ist die Temperatur genau zu kontrollieren.
Der Ablauf der PCR,welcher dem der natürlichen DNA-Replikation sehr ähnlich ist,läuft in drei Schritten ab:
1. Denaturierung:
Der vorhandene DNA-Abschnitt wird im Reaktionsansatz auf ca. 95°C erhitzt.Dieser Temperaturanstieg hat zur Folge,dass sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden komplementären Nukleotidsträngen lösen uns sich auch die natürlich vorhandenen Primer abtrennen.Am Ende dieses etwa 30 sekunden dauernden Schrittes liegen nun DNA-Einzelstränge vor.
2. Primerhybridisierung:
Nach der Denaturierung wird der Reaktionsansatz auf 50-65°C abgekühlt,die genaue Temperatur ist abhängig von dem verwendeten Primer.Wichtig ist,dass die Temperatur unter dem Schmelzpunkt des Primers liegt,da sich ansonsten die beiden Primer an die falschen stellen der DNA anlagern würden (Misspriming).
Die künstlich erzeugten DNA-Primer passen jeweils komplementär an eine ganz bestimmte Stelle des DNA-Abschnittes und lagern sich die beiden Nukleotidstränge an.Diese maßgeschneiderten Primer bestehen aus 18-30 Nukleotiden,der Schritt der Hybridisierung dauert ca. 30 Sekunden.
3. Elongation/Polymerisation:
Bei diesem letzten Schritt tritt die in der Lösung vorhandene Taq-DNA-Polymerase in Erscheinung,die aufgrund ihrer Hitzestabilität verwendet wird.Da ihr Hitzeoptimum bei 72°C liegt,wird der Reaktionsansatz auf diese Temperatur gebracht damit die DNA-Polymerase arbeiten kann.Aufgrund der Arbeitsrichtung der Polymerase vom 5′ zum 3′ Ende des zu synthetisierenden DNA-Stranges,lagert sie vom Beginn des 3′-Endes des vorher angelagerten Primers die freien Nukleotide komplementär an die beiden Matrizenstränge an.Am Schluss liegen nun zwei genetisch identische Komplementärstränge vor,die nun als Vorlage für den nächsten PCR-Zyklus dienen können.Es ist so möglich die DNA-Menge mit jedem Zyklus in nur wenigen Minuten zu verdoppeln.Meistens werden die zur PCR benötigten Schritte 25-40 mal wiederholt,die Menge an Erbmaterial wächst somit exponentiell und man hat nach n Zyklen theoretisch 2n DNA-Kopien.
Die Anwendungsgebiete der PCR:
- In der Paläobiologie zur Analyse fossiler DNA
- Vaterschaftstest
- Genetischer Fingerabdruck
- Mutagenese
- Geschlechtsbestimmung
- Erkennung von Krankheiten,Gewebeverträglichkeiten
- Aufspürung von Krankheitserregern
- Klonierung von Genen
Schema zur DNA Vervielfältigung durch PCR
