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Name:Daniel Peters, 2019-12

 

Plasmide sind ringförmiges extrachromosomales Erbgut in Bakterien, welche durch parasexuelle Vorgänge zwischen Bakterien ausgetauscht werden.

 

Plasmide als Vektoren

- Gentechnisch veränderte DNA-Elemente, die sich eigenständig replizeren

- Natürliches Vorkommen in Bakterien und zum Teil in Hefezellen

- Verwendung: Einbau fremder DNA-Sequenzen in eine Wirtszelle=>Herstellung eines rekombinanten Organismus

- Tragen Gene, die ihrer Wirtszelle spezifische Eigenschaften verleihen, um sie von Zellen ohne Plasmid unterscheiden zu können=>feststellen, ob der Gentransfer geglückt ist (,,Selektionsvorteil": i.d.R. Antibiotikaresistenz). In diesen Genen befinden sich Schnittstellen für Restriktionsenzyme.

- Einbau einer Spender-DNA in darf keine wesentlichen Funktionen der Plasmide stören

- Tragen Replikationsursprung (Ori), welcher für eigenständige Replikation nötig ist

 

Bild: https://de.wikipedia.org/wiki/Plasmid#/media/Datei:Example_plasmid.png

 

Biologische Bedeutung von Vektoren:

- Ringförmigkeit des Plasmids => nötig für Stabilität
- Genübertragung ist möglich (Fruchtbarkeitsgene)
- Plasmide enthalten z.T. entbehrliche Informationen: Resistenzgene
- Plasmide überspringen bakterielle Artgrenzen
- Plasmide können ohne Selektionsdruck (Notwendigkeit der Anpassung aufgrund externer Einflüsse) verloren gehen
- Plasmide können sich in das Bakterienchromosom integrieren

 

Ti-plasmid:

- Wildtyp über 250000 Bp
- Befindet sich in Agrobacterium tumefaciens: induzieren Tumore bei Pflanzen
- verursacht Gewebewucherungen, Wurzelgallenkrebs
- bei 28°C geht die tumorbildende Fähigkeit verloren =>Plasmide aus Zellen eliminiert

Gene auf dem Ti-Plasmid:

- Transfergene (tra-Gene)
- Virulenzgene (vir-Gene)
- Gene für Abbau von Opin
- t-DNA mit eukaryotischer Struktur (in Pflanzen-DNA integrierbar):

 • Tumorgenesegene (onc-Gene) (notwendig für Tumorinduktion) 
 • Opinsynthesegene (ops-Gene) (Synthese von Opinen)
 • t-DNA wird von zwei Grenzen begrenzt (left border und right border)

- Ori: Replikationsursprung

Bild: https://de.wikipedia.org/wiki/Ti-Plasmid#/media/Datei:Ti-Plasmid.svg

 

Mechanismus der Genaktivierung und –übertragung

- Stoffe, die aus verwundeten Pflanzen austreten aktivieren das Produkt des virA-Genes, welches das virG-Gen aktiviert.
=> VirG: Responseregulator=> aktiviert andere vir-Gene: virD, virE, virB.
=> VirD verursacht am rechten Rand der t-DNA einen Einzelstrangbruch, ein komplementärer Strang der t-DNA wird synthetisiert.
=> VirE stabilisiert die einzelsträngige t-DNA.
=> Produkt von VirB: in bakterieller Membran vorhanden => bei direktem Kontakt zu einer Pflanzenzelle sorgt es für Übertragung der einzelsträngigen T-DNA. -> Ähnelt der Konjugation.

Integration der t-DNA:

- virE-Protein: wird zusammen mit der t-DNA entlang des Cytoskeletts in den Zellkern transportiert=> sorgt weiterhin für Stabilität
- Integration in Pflanze-DNA: unspezifisch, an manchen Basensequenzen wahrscheinlicher

Wirkung der t-DNA:

  • durch zusätzliche Synthese von Auxin und Cytokinin (Wachstumsfaktoren) wird der Hormonhaushalt der Pflanze gestört. => Pflanzenzellen teilen sich, Wucherungen (,,Gallen“) entstehen.
  • ops-Gene: Opinsynthese. Gene für Abbau der Opine nicht mit übertragen => stehen den Zellen nicht als Stickstoff/ Energiequelle zur Verfügung

Anwendung in der Gentechnik:

- Ti-Plasmide werden für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet
- Dabei: unerwünschte tumorinduziernende Gene durch gewünschte Gene ersetzt
- Notwendig für Transformation: Pflanzen durch Nematoden (Fadenwürmer) auf zellulärer Ebene beschädigt=> Infektion durch Agrobakterien
- genetisch veränderte Pflanzen z.B. :
 • Gen-Mais
 • Anti-Matsch-Tomate
 • Getreide
- Um fremde Gene zu begrenzen: binäre Vektoren:
- 2 Plasmide: 1 mit vir-Region, ohne t-DNA und 1 mit t-DNA + einzusetzendes Gen ohne vir-Region

 

Für mehr Informationen:

- https://de.wikipedia.org/wiki/Ti-Plasmid
- https://de.wikipedia.org/wiki/Vektor_(Gentechnik)

 

Das Plasmid pBR322

 

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