Name: Valentin R., 2017-01
DNA-Sequenzierung
Definition:
Die DNA-Sequenzierung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Basenfolgen in der DNA, sie wird also angewendet um herauszufinden, wie die Nukleotidbasen Andenin, Guanin, Cytosin und Thymin (bzw. Uracil) aufeinander folgen. Diese Methode wird u.a. eingesetzt, um Erbkrankheiten zu untersuchen. Die Sequenzierung ist aber generell in der Genetik kaum noch wegzudenken, da man den Speicherort verschiedener Erbinformationen auf der DNA finden kann und sie somit grundlegend für jede DNA-Vervielfältigung ist. Um den Aufbau der DNA zu ermitteln, gibt es verschiedene Sequenzierungsmethoden.
Grundlagen für diese Methoden gehen aber auf die beiden klassischen Methoden von Maxam und Gilbert bzw. Sanger zurück, die die Methode erstmals um 1975 anwendeten. Die vollständige Sequenzierung eines menschlichen Erbguts war aber erst in 2001 abgeschlossen.
Methode von Maxam und Gilbert:
Diese Methode der DNA Sequenzierung nutzt vier verschiedene (gefährliche) chemische Stoffe, mit denen man jeweils eine Base nachweisen kann. Zuerst wird die DNA mit einem radioaktiven Primer markiert und anschließend durch Denaturierung in Einzelstränge geteilt. Darauf wird in vier unabhängigen Vorgängen jeweils eine der vier Basen vom Basentriplett (bestehend aus Phosphat, Zucker und der Base) abgespalten. Guanin wird beispielsweise an Dimethylsulfat gebunden und anschließend mit der Flüssigkeit Piperidin abgespalten, sodass überall dort, wo Guanin fehlt, eine basenlose Lücke im DNA-Strang entsteht.
An diesen Lücken wird dann der DNA-Strang gespalten, sodass durch zufällige Trennung an verschiedenen Guanin-Stellen Teilstücke mit verschiedener Länge entstehen. Diese Teilstücke sind nun am 3'-Ende an einer Stelle abgeschnitten, wo vorher eine Guaninbase lag. Sie werden mithilfe der Gel-Elektrophorese der Länge nach sortiert, sodass man nach den vier regional getrennten Abspaltungsvorgängen den Standort der einzelnen Basen ablesen kann.
Didesoxymethode nach Sanger:
Die weitaus bekanntere und öfter angewendete Methode ist die Didesoxymethode (auch Kettenabbruchmethode) nach Sanger, da sie nicht mittels gefährlicher Stoffe durchgeführt werden muss und einfacher automatisiert werden kann. Der Ablauf beginnt mit der Denaturierung des DNA-Doppelstrangs. Liegt die DNA im Einzelstrang vor, wird ein künstlicher Primer angesetzt, der den Startpunkt der Synthese festlegt. Nun wird der Einzelstrang in vier Reagenzgläser gegeben, in denen die zur Synthese nötigen Desoxynucleotid-Triphosphaten dATP, dTTP, dCTP und dGTP vorliegen. Zusätzlich wird in jeweils eines der vier Gläser ein ddATP, ddTTP, ddCTP oder ddGTP Didesoxynucleotid-Triphosphat in einer geringen Konzentration zugegeben.
Diesen besonderen Triphosphaten fehlt ein Hydroxy(-OH)gruppe, sodass sie kein weiteres Nukleotid mehr binden können und zum Abbruch des synthetisierten Strangs führen (daher der Name Abbruchnukleotid). Nach der Zugabe einer DNA-Polymerase in das Reagenzglas werden die vier Halbstränge also immer so lange synthetisiert, bis die Polymerase statt einem normalen Nukleotid zufällig ein Abbruchnukleotid einbaut und somit die Synthese abgebrochen wird.
Wie bei der Maxam- und Gilbert- Methode entstehen unterschiedlich lange Teilstücke, die mit der Gelelektrophorese dem Gewicht(=der Länge) nach geordnet werden. Nun kann man beispielsweise an den Abbruchstellen, die durch das Abbruchnukleotid von Adenin verursacht wurden, ein Adenin vermerken. So kann man nach und nach über die Länge der Teilstücke die Basenabfolge bestimmen.
