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Genetik: Splicing

Name: Marie K., 2022-01

 

Spleißen (Splicing)

(Fokus auf dem biochemischen Ablauf)

1.Einleitung

Im Gegensatz zu Prokaryoten besitzen eukaryotische Zellen sogenannte ,,Mosaikgene“. Ihre primäre RNA (auch ,,unreife RNA“, ,,präRNA“ oder ,,hnRNA“) trägt demnach codierende- und nichtcodierende Sequenzen. Die codierenden Bereiche nennen sich Exons (expressed region). Die nichtcodierenden Abschnitte der DNA bzw. der präRNA werden Introns (intervening region) genannt. Jedes Intron ist durch eine bestimmte Sequenz (AAUAA) gekennzeichnet.

 

1.1 Einordnen in Proteinbiosynthese

Das Spleißen ist ein Vorgang, der an das Ende der RNA Prozessierung, bei der unreife mRNA zu translatierbarer mRNA reift, eingeordnet werden kann. Es schließt den Reifeprozess, der das ,,Capping“ (umwandeln des 5‘-Endes der RNA in eine Cap-Struktur durch ein modifiziertes Guanintriphosphat) und die ,,Polyadenylierung“ (Anhängen einen Polyadenosinschwanzes (100-250 Adenosintriphosphate)) enthält, ab, indem Introns aus der RNA entfernt werden. Im Anschluss findet die Translation statt, nach der die Proteinbiosynthese abgeschlossen ist (Abb.1 & Abb.2). Der gesamte Vorgang findet im Zellkern statt.

(Abb.1 & Abb.2)

 

1.3 Allgemeiner Ablauf

Zum Entfernen der Introns aus der RNA, muss zuerst die 5‘-splice site (vgl. Abb. 3 & Abb.5a),, aufgebrochen“ werden. Am 5‘-Exon bleibt dann eine Phosphatgruppe ,,übrig“. Das halb losgelöste Intron biegt sich in eine lassoähnliche Form, was dem 3‘-Ende des 5‘-Exons ermöglicht eine Verbindung zum 5‘-Ende des 3‘-Exons herzustellen (durch einen Angriff auf die Phosphodiestherbrücke zwischen Intron und 3‘-Exon). Somit sind beide Exons verbunden und das Intron ist entfernt.


(Abb3)

Spleißen ist auf zwei verschiedene Arten möglich: Das Spleißen mithilfe von Spleißosomen und das Selbstspleißen (autokatalytisches Spleißen).

 

2.1 Das Spleißen mithilfe von Spleißosomen

Das Spleißosom besteht aus 5 snRNPs (=small nuclear ribonucleoproteins) mit jeweils unterschiedlichen snRNAs und führt die Spleißaktion durch. snRNP ist ein Komplex aus Proteinen und snRNA, die spezielle Stellen der Introns erkennen kann. Schon während der Transkription binden die snRNAs an die RNA, da sie kurze homologe Sequenzen aufweisen. Das Binden der snRNPs an die prä-RNA geschieht durch äußere Proteine (Spleißfaktoren). Ihre Struktur ähnelt häufig der von RNA Helicasen. Weil die snRNAs sehr uracilhaltig ist, nennt man die verschiedenen snRNAs U1, U2,U4,U5 und U6.


(Abb4)

Im Prozess des Spleißens binden die snRNPs an Exon-Intron Übergänge und entfernen durch zwei aufeinanderfolgende Umesterungen das Intron zwischen den Exons. Die ,,übriggebliebenen“ Introns bleiben im Spleißosom und werden mit ihm gemeinsam nach kurzer Zeit wieder abgebaut. (Abb.4)

 

2.2 autokatalytisches Spleißen

Für das autokatalytische Spleißen ist ein bestimmter Aufbau im Intron nötig, der i.d.R. ab einer Länge von 400 Nukleotiden vorliegt. Es bestehen zwei verschiedene Arten von Introns: Gruppe I Introns und Gruppe II Introns. Das Besondere bei dieser Art des Spleißens ist, dass keine Energie verbraucht wird!
Im Falle von Gruppe I Introns ist statt eines Energielieferanten wie GTP nur Guanosin als Cofaktor nötig (vgl.Abb.5a & 5b). An dem, in der RNA gebundenen, Guanosin hängt eine OH-Gruppe, die die 5‘-Spleißstelle angreift (1). Somit löst sich eine Phosphodiesterbindung an der Spleißstelle und gleichzeitig entsteht eine Phosphodiesterbindung zum Guanin. Insgesamt wurde also keine Energie verbraucht. Das neu entstandene 3‘-OH-Ende des 5‘-Exons greift nun an der 3‘-Spleißstelle an, was zur Folge hat, dass die Exons verknüpft sind und das Intron herausgeschnitten ist (2&3). Damit dieser Vorgang so stattfinden kann, muss das Guanosin an einer bestimmten Stelle im Intron vorkommen und die RNA muss eine Sekundarstruktur aufweisen .


(Abb.5a&b).

Im Falle von Gruppe II Introns ist der Cofaktor Guanosin nicht nötig. Vorraussetzung ist auch hier die richtige Faltung der RNA. Dadurch kommt die 3‘-Spleißstelle der OH-Gruppe eines Adenosinbausteins nahe genug, um einen nukleophilen Angriff auszulösen. Ähnlich dem Spleißosom entsteht auch hier wieder eine Lassostruktur des Introns, die eine Verbindung des 3‘-Endes des 5‘-Exons und des 5‘-Endes zur Folge hat (vgl. Abb. 6a & 6b).
Alternatives Spleißen beschreibt die ,,Neusortierung“ der Exons nach dem Spleißen. Die Rekombination führt zu einer sehr großen Variabilität des Proteoms (Gesamtheit aller Proteine). So können auch mit nur ,,wenigen“ Genen für über 20.000 verschiedene Proteine codiert werden.

 

3.Erweiterung: Splicing von t-RNA

Im Gegensatz zu Bakterien, deren Splicing von tRNA autokatalytisch ist, findet sowohl bei Eukaryoten als auch bei Archaea ein enzymgesteuerter Mechanismus statt. Die Introns sind 14 bis 60 Basen lang. Anders als beim Splicing der präRNA werden sie hier in drei Schritten entfernt und anhand der Struktur des gesamten Moleküls erkannt. Zuerst wird die prä-tRNA zweimal durch eine Endonuklease zerteilt, sodass zwei sog. tRNA Halbmoleküle entstehen.
Dabei entsteht zyklisches 2’ 3’ Phosphat des 5’ Halbmoleküls. Dieses wird anschließend zu einem 2’ Phosphat und einer 3’ OH-Gruppe hydrolysiert (=Spaltung durch Reaktion mit Wasser), während die 5’ OH Gruppe des 3’ Halbmoleküls phosphoryliert wird (es wird eine reversible Phosphorgruppe angehängt). Hierbei wird GTP verbraucht. Eine Verknüpfung mithilfe des Enzyms Ligase ist nun möglich. Zuletzt wird das 2’Phosphat unter NAD Verbrauch entfernt (vgl. Abb.8)
Alternatives Spleißen beschreibt die ,,Neusortierung“ der Exons nach dem Spleißen. Die Rekombination führt zu einer sehr großen Variabilität des Proteoms (Gesamtheit aller Proteine). So können auch mit nur ,,wenigen“ Genen für über 20.000 verschiedene Proteine codiert werden.

 

3. Erweiterung: Splicing von t-RNA

Im Gegensatz zu Bakterien, deren Splicing von tRNA autokatalytisch ist, findet sowohl bei Eukaryoten als auch bei Archaea ein enzymgesteuerter Mechanismus statt. Die Introns sind 14 bis 60 Basen lang. Anders als beim Splicing der präRNA werden sie hier in drei Schritten entfernt und anhand der Struktur des gesamten Moleküls erkannt. Zuerst wird die prä-tRNA zweimal durch eine Endonuklease zerteilt, sodass zwei sog. tRNA Halbmoleküle entstehen.
Dabei entsteht zyklisches 2’ 3’ Phosphat des 5’ Halbmoleküls. Dieses wird anschließend zu einem 2’ Phosphat und einer 3’ OH-Gruppe hydrolysiert (=Spaltung durch Reaktion mit Wasser), während die 5’ OH Gruppe des 3’ Halbmoleküls phosphoryliert wird (es wird eine reversible Phosphorgruppe angehängt). Hierbei wird GTP verbraucht. Eine Verknüpfung mithilfe des Enzyms Ligase ist nun möglich. Zuletzt wird das 2’Phosphat unter NAD Verbrauch entfernt (vgl. Abb.8).

 

4. Splicing und Krankheiten

Ohne das Spleißen oder im Falle einer Mutation an einer für das Splicing elementaren Sequenz (wie AAUAA) würden nichtcodierende Abschnitte im Laufe der Proteinbiosynthese translatiert werden oder Teile der Exons fehlen, was missfunktionelle Proteine zur Folge hätte, die die Lebensfähigkeit des jeweiligen Organismus enorm einschränken und zu erblichen Krankheiten führen können.
Wenn beispielsweise eine Mutation dazu führt, dass unklare splice sites entstehen und deshalb ein Teil des Introns mit in die reife RNA aufgenommen wird, kann dies die Krankheit β-Thalassämie major (autosomal rezessiv vererbbar) auslösen. Aufgrund deutlicher Blutarmut sind Patienten dieser Krankheit ständig auf Infusionen angewiesen. Das Spleißen ist daher ein sehr wichtiger und präziser Vorgang.
Weitere durch misslungenes Splicing entstehende Krankheiten sind das Ehlers-Danlos Syndrom oder die spinale Muskelatrophie)

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