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Name: Sarah Hinder, 2020-01

CRISPR/Cas9-System

Definition: Abwehrsystem von Bakterienzellen gegenüber Phageninfektion
  -> Die Phagen-DNA wird zerstört

Bakterielle DNA: Der CRISPR-DNA-Bereich in der bakteriellen DNA besteht aus Repeats und Spacer. In der Nähe dieses Bereiches liegen unter anderem Cas-Gene, die Cas-Proteine codieren. Diese Proteine sind für das Erkennen viraler (fremder) DNA (-> Cas1+ 2) oder für das Zerschneiden dieser verantwortlich (-> Cas9). Vor den Cas-Genen liegt das tracr-Gen, das später in die tracr-RNA transkribiert wird.

Phagen-DNA: Vor dem Protospacer befindet sich eine Erkennungsregion PAM.

Bakterielles Crispr/Cas9 DNA-System

Bakterielles Crispr/Cas9 DNA-System (klicken zum Vergrößern)

 

 

Die 3 Phasen des Abwehrmechanismus:

 

Drei Phasen des Abwehrmechanismus bei Crispr/cas9

Drei Phasen des Abwehrmechanismus bei Crispr/Cas9 (Klicken zum Vergrößern)

 

a) Immunisierungsphase:

Protospacer der Phagen-DNA wird in den CRISPR-DNA-Bereich des Wirtsgenoms eingefügt
-> 1) Phageninfektion (Erstinfektion), wodurch Phagen-DNA in die Wirtszelle gelangt. Darauf befindet sich der Protospacer mit davor gelegener PAM-Sequenz
     2) Die auf der bakteriellen DNA gelegenen Cas-Gene werden transkribiert und translatiert. Es entstehen Cas-Proteine, die den Protospacer mithilfe der PAM-Sequenz erkennen, aus der viralen DNA entnehmen und in den CRISPR-DNA-Bereich der bakteriellen DNA als neuen Spacer einfügen.

b) Expressions- und Prozessierungsphase:

Herstellung eines CRISPR-Cas9-Komplexes
-> Der ganze CRISPR-DNA-Bereich wird in eine Prä-crRNA übersetzt.
     Das Cas9-Gen wird in das Cas9-Protein transkribiert und translatiert.
     Das vor den Cas-Genen und dem CRISPR-DNA-Bereich gelegene tracr-Gen wird in eine tracr-RNA übersetzt.
     Mithilfe der RNAse III entstehen genauso viele CRISPR/Cas9-Komplexe aus den vorher entstandenen Bausteinen wie Spacer in der bakteriellen DNA vorhanden sind.

c) Interferenzphase:

Nach erneuter Phageninfektion wird die parasitäre DNA erkannt und zerstört
-> Wenn dann ein Bekannter Phage die Bakterienzelle erneut infiziert (Zweitinfektion), kommt es zur Wiedererkennung der viralen DNA mithilfe der entsprechenden crRNA des CRISPR/Cas9-Komplexes. Diese crRNA ist komplementär zur viralen DNA, wodurch das Cas9-Protein an die Phagen-DNA anlagern kann und diese spezifisch zerschneidet. Dadurch wird diese unschädlich gemacht.

 

Worterklärungen:     

  • Phagen = Viren, die Bakterien befallen
  • Repeats = kurze Sequenz-Wiederholungen
  • Spacer = Abstandhalter, enthalten Phagen-DNA-Sequenzen; genauso viele Spacer wie überstandene virale Attacken = Archiv parasitärer Phagen-DNA
  • Virale DNA = Phagen-DNA = parasitäre DNA
  • Protospacer = DNA-Sequenz der Phagen, die in das Wirtsgenom eingebaut wird (mithilfe der Cas-Proteine)
  • PAM = ein charakteristisches Basentriplett aus zwei Guaninbasen und einer beliebigen Base; liegt neben dem Protospacer der viralen DNA
  • RNAse III = RNA spaltendes Enzym -> sie zerkleinert die Prä-crRNA
  • Cas9-Protein = Endonuklease -> zerschneidet virale DNA

 

Zukünftige Ziele von CRISPR/Cas9:

- Potential für revolutionäre Behandlungsmöglichkeiten von Krankheiten und für die Optimierung von Pflanzen
- In der Medizin ist das Ziel Krebs, Erbkrankheiten und HIV heilen zu können (Versuche an Mäusen waren erfolgreich für das heilen von Erbkrankheiten)
- In der Pflanzenzüchtung ist das Ziel die Pflanzen vor Schädlingen, Krankheitserregern und Wetterextremen zu schützen
- In Tieren menschliche Spenderorgane zu züchten

 

Anwendung von CRISPR/Cas9:

Genome-Editing: CRISPR/Cas9 verursacht Mutationen. Die Bearbeitung der einzelnen DNA-Bausteine geschieht gezielt und präzise. Das System funktioniert nicht nur in Bakterien, sondern in allen Organismen. Forscher können damit Gene ausschalten oder an der Schnittstelle neue Abschnitte einfügen.

 

Schwierigkeiten von  CRISPR/Cas9 in der Anwendung:

- Risiko der off-Target-Effekte -> treten auf, wenn die DNA-Abfolge der crRNA mit einem vorhandenen Abschnitt in der fremden DNA übereinstimmt
=> Wahrscheinlichkeit von off-Target-Effekten wird durch Verlängerung der crRNA verringert
- HIV-Erreger scheinen schnell gegen die „Genschere“ resistent zu werden
- Das Editieren von Keimzellen ist ethisch umstritten, da es das Erbgut künftiger Generationen dauerhaft verändert
- Probleme beim injizieren der „Genschere“

 

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